RNA-seq概述

转录组测序原理与实验流程

王诗翔 副教授
中南大学生物医学信息系

2026-03-21

课程大纲

本讲内容

  1. RNA-seq技术简介
  2. 实验流程与文库制备
  3. 测序原理与平台
  4. 实验设计原则
  1. 批次效应与控制
  2. 数据质控指标
  3. 测序深度与重复数
  4. 常见问题

第1部分：RNA-seq技术简介

1.1 什么是RNA-seq？

RNA-seq（RNA sequencing） 是利用高通量测序技术对转录组进行定量和定性分析的方法

RNA-seq的核心能力

  • 定量分析 — 测定每个基因的转录本丰度
  • 差异分析 — 比较不同条件下基因表达变化
  • 新转录本发现 — 鉴定新的基因和剪接异构体
  • 等位基因表达 — 分析杂合子中等位基因特异性表达

1.2 RNA-seq vs 芯片技术

特性 RNA-seq 芯片（Microarray）
检测范围 全转录组（已知+未知） 预设探针（已知基因）
灵敏度 高，可检测低表达基因 中等，受背景噪音影响
动态范围 宽（>10^4） 窄（~10^2）
发现能力 新转录本、融合基因 限于已知序列
成本 逐渐降低 相对较低

结论：RNA-seq已成为转录组研究的标准方法

1.3 RNA-seq生物医学应用

研究领域

  • 🧬 肿瘤研究 — 癌症驱动基因、分型标志物
  • 💊 药物研发 — 药物反应预测、靶点发现
  • 🧫 发育生物学 — 时空表达模式分析
  • 🦠 免疫学 — 免疫细胞活化状态评估

临床转化

  • 疾病分子分型
  • 预后标志物发现
  • 治疗靶点筛选
  • 精准医疗指导

第2部分：实验流程

2.1 整体流程图

样本采集 → RNA提取 → mRNA富集 → 片段化 → cDNA合成
                                                ↓
结果分析 ← 数据处理 ← 测序 ← 文库制备 ← 接头连接

关键质控点： - RNA完整性（RIN > 7） - 文库浓度和片段大小 - 测序质量（Q30 > 85%）

2.2 RNA提取与质控

关键指标

指标 要求 说明
RIN值 > 7 RNA完整性，Bioanalyzer检测
浓度 >100 ng/μL NanoDrop或Qubit检测
纯度 A260/A280 = 1.8-2.1 蛋白污染检测

警告

注意：RNA易降解，提取后应立即进行后续步骤或-80°C保存

2.3 mRNA富集策略

poly-A选择

适用：真核生物、完整RNA样本

优点： - 富集成熟mRNA - 数据利用率高 - rRNA污染低

缺点： - 丢失非编码RNA - 无poly-A的转录本丢失 - 不适合降解样本

rRNA去除

适用：原核生物、降解样本

优点： - 保留非编码RNA - 更全面的转录组 - 适合FFPE样本

缺点： - rRNA残留可能较高 - 数据复杂度增加

第3部分：测序原理

3.1 Illumina测序（边合成边测序）

原理步骤

  1. 文库变性 — 双链DNA变性为单链
  2. 杂交 — 与flow cell上的接头序列结合
  3. 桥式PCR扩增 — 形成簇（cluster）
  4. 测序引物结合
  5. 循环测序 — 加入荧光标记的dNTP
  6. 图像采集 — 读取每个碱基的荧光信号

3.2 测序模式选择

模式 read长度 应用场景 成本
SE50 50 bp单端 基因表达定量 低
SE75 75 bp单端 常规表达分析 中
PE100 100 bp双端 剪接分析、新转录本 高
PE150 150 bp双端 复杂转录组、融合基因 最高

推荐：一般表达分析用PE100-150

3.3 测序深度与重复数

推荐测序深度

分析类型 reads/样本 说明
基因表达定量 10-30 M 标准差异分析
差异剪接 50-100 M 需要更高覆盖度
融合基因检测 >100 M 低丰度事件检测
单细胞测序 50K-500K/细胞 依细胞类型而定

生物学重复数

  • n=3：最低要求（细胞系）
  • n=4-5：推荐（人临床样本）
  • n≥6：高异质性样本

原则：生物学重复 > 测序深度

第4部分：实验设计

4.1 实验设计基本原则

1. 对照组设置 — 必须设置对照组
2. 随机化 — 样本处理顺序随机
3. 平衡设计 — 各组样本数相等
4. 盲法 — 减少操作偏差
5. 详细记录 — 批次、日期、操作者

重要

关键：实验设计决定分析的上限，设计缺陷无法通过分析弥补

4.2 常见实验设计类型

两两比较（最常见）

对照组 (n=3)    vs    处理组 (n=3)
   ↓                    ↓
 提取RNA              提取RNA
   ↓                    ↓
建库测序             建库测序
   ↓                    ↓
   ←—— 差异分析 ——→

配对设计

同一患者：治疗前 (n=20) vs 治疗后 (n=20)
        ↓
配对分析：控制个体差异，提高统计效能

第5部分：批次效应

5.1 什么是批次效应？

批次效应（Batch Effect）：由非生物学因素引起的系统性差异

主要来源

来源 影响程度 示例
操作者 高 不同人员操作习惯差异
时间 高 不同日期提取RNA
试剂批次 中 不同批次试剂性能差异
仪器 中 不同测序仪、flow cell

5.2 批次效应识别

可视化方法

  • PCA — 批次是否聚类在一起
  • 热图聚类 — 样本是否按批次聚类
  • UMAP/t-SNE — 高维数据可视化

异常表现

❌ 错误：样本按批次聚类，而非生物学分组
✅ 正确：样本按生物学条件聚类

5.3 批次效应控制

设计阶段控制（首选）

✅ 推荐：块设计（Block Design）

Day 1: 对照1-3 + 处理1-3
Day 2: 对照4-6 + 处理4-6

❌ 避免：
Day 1: 所有对照组
Day 2: 所有处理组

分析阶段校正

方法 R包 适用场景
ComBat sva 已知批次变量
ComBat-seq sva RNA-seq计数数据
纳入设计公式 DESeq2 批次作为协变量

第6部分：数据质控

6.1 测序质量分数（Phred Score）

Q = -10 × log10(P)  （P为错误概率）
Q值 准确率 错误率 评价
30 99.9% 0.1% 优秀
20 99% 1% 可接受
<20 <99% >1% 差

要求：Q30 > 85%

6.2 比对率指标

指标 可接受 良好 优秀
总比对率 >70% >85% >90%
唯一比对率 >60% >75% >85%
rRNA比例 <10% <5% <2%

警告

低比对率可能原因： - 接头未去除干净 - 样本污染 - 参考基因组选择错误

第7部分：常见问题

7.1 RNA-seq常见问题

Q1: 选择poly-A还是rRNA去除？

  • 完整RNA+真核生物 → poly-A
  • 降解样本/原核生物 → rRNA去除

Q2: 单端还是双端测序？

  • 仅表达定量 → SE75
  • 剪接分析/新转录本 → PE100-150

Q3: 如何判断测序深度是否足够？

  • 基因检出数（通常>10,000）
  • 饱和曲线分析
  • 样本间相关性

7.2 实验设计检查清单

总结

RNA-seq实验要点

  1. 技术优势 — 全转录组覆盖、高灵敏度、发现新转录本
  2. 实验流程 — RNA提取 → mRNA富集 → 片段化 → cDNA合成 → 接头连接 → 测序
  3. 测序参数 — PE100-150用于剪接分析，10-30M reads/样本，n≥3重复
  4. 实验设计 — 对照组、随机化、平衡设计、详细metadata记录
  5. 批次效应 — 设计阶段控制优于分析阶段校正

谢谢！

联系方式

📧 wangshx@csu.edu.cn 🌐 https://wanglabcsu.github.io/ 🐙 https://github.com/WangLabCSU

延伸阅读

  1. Wang Z, et al. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 2009
  2. Conesa A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016
  3. Leek JT, et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects. Nat Rev Genet. 2010